Введение
Окислительный стресс (ОС) – это изменение внутреннего равновесия клеточной среды под влиянием различных патологических факторов, обусловленное дисбалансом в системе «окисление/антиоксидантная защита». ОС провоцирует клеточное и тканевое повреждение, апоптоз клеток, а также потенциально способен негативно влиять на многие реакции, происходящие в клетках и тканях организма [1].
ОС представляет собой дисбаланс, выражающийся в чрезмерном уровне свободных радикалов (СР), присутствующих в организме, и недостаточном количестве антиоксидантов, способных нейтрализовать данные радикалы [2]. СР – это химические частицы (атомы, молекулы или ионы), содержащие один или несколько неспаренных электронов на внешних орбиталях, что обусловливает их высокую реакционную способность [3].
Свободнорадикальное окисление (СРО) протекает во всех органах и тканях, являясь нормальной метаболической реакцией. Данный процесс необходим для регуляции транспорта веществ через мембраны, синтеза простагландинов, лейкотриенов, стероидных гормонов и катехоламинов [1, 4]. СР кислорода вырабатываются как компонент нормального метаболического процесса [3].
Рост количества СР может усиливаться под воздействием различных физических и химических факторов: химиотерапевтическое воздействие, ионизирующая радиация, ультрафиолетовое облучение, техногенные загрязнители атмосферы, табачный дым, ксенобиотики [5]. Продукция СР увеличивается также под влиянием токсических, аллергических, воспалительных процессов, что в свою очередь может провоцировать различные патологические состояния: опухолевый рост, преждевременное старение [6]. СР принимают участие в патогенезе более 200 заболеваний и патологических состояний. При этом для разных заболеваний характерна однонаправленность изменений внутренней среды и функциональных нарушений кровеносных сосудов, что позволяет говорить о едином механизме их развития [7].
Одним из продуктов СРО являются активные формы кислорода (АФК), которые можно разделять по источнику происхождения на экзогенные и эндогенные. Образование экзогенных АФК происходит под воздействием внешних факторов: лекарственных препаратов, ионизирующего излучения. Эндогенные АФК являются продуктом внутриклеточного аэробного метаболизма, среди которых первичным источником является дыхательная цепь митохондрий [1]. В низких концентрациях АФК играют важную роль в организме человека, например в борьбе с патогенами [8]. При инвазии патогенных микроорганизмов фагоциты синтезируют и высвобождают СР [9].
Индукция АФК и азота является важным компонентом патогенеза многих заболеваний. Атака эндогенных и экзогенных СР вызывает конформационные и окислительные изменения биомолекул, нарушение структуры ДНК [10].
Влияние вирусных инфекций на ОС
O.M. Guillin et al. (2019) показали, что ряд вирусов индуцируют ОС, чтобы ускорить их репликацию внутри клетки [11]. Вирусы используют различные механизмы для индукции ОС, который был первоначально описан в 1979 г. для вируса Сендай [12]. Подтверждено развитие ОС при многих вирусных инфекциях [13]. Данная патология особенно характерна для инфицирования респираторно-синцитиальным вирусом человека [14] и вирусами гриппа [15]. По данным аутопсии пациентов, инфицированных вирусом гриппа А, у них наблюдался высокий уровень окисленных молекул ДНК, липидов, белков. В образцах, взятых из легочной ткани, выявлено повышение продукции АФК и высокий уровень окисленных белков, указывающий на формирование ОС в процессе иммунного ответа [12].
Формирование СР – важный защитный механизм, лежащий в основе неспецифического иммунитета: фагоцитоз приводит к многократному увеличению содержания СР в фагоцитирующих клетках с одновременным повышением потребления кислорода в 20 и более раз, происходит т.н. дыхательный взрыв. АФК являются основой патогенеза многих патологических процессов, обладают антигенными свойствами, запускают аутоиммунные процессы повреждения тканей [16]. В статье M. Laforge et al. (2020) обсуждается генерация избытка АФК при воспалении, что приводит к более тяжелому течению заболеваний. Чрезмерное количество АФК усиливает местную воспалительную реакцию, и она приобретает системный характер [17]. Именно чрезмерная продукция АФК, приводящая к ОС, служит основной причиной локального или системного повреждения тканей, что способствует развитию тяжелой формы COVID-19 [18].
В целом практически все пациенты с вирусными инфекциями страдают от хронического ОС, влияющего на патогенез заболевания, включая нарушение иммунных функций, воспалительную реакцию [19].
Для предотвращения негативного влияния больших концентраций продуктов СРО на организм существует антиоксидантная система (АОС) защиты, с помощью которой АФК и азота восстанавливаются до нетоксичных форм [20]. Общая эндогенная АОС состоит из ферментативных антиоксидантов, таких как супероксиддисмутаза (SOD), каталаза (CAT), глутатионпероксидаза (GPx) и тиоредоксин (Trx), и неэнзиматических антиоксидантов: витамины или их аналоги (витамины А, С и Е, коэнзим Q10, флавоноиды), минералы (селен и цинк) и метаболиты (билирубин и мелатонин) [21].
ОС после перенесенной вирусной инфекции как компонент патогенеза алопеции
Роль ОС подтверждена при многих дерматологических заболеваниях, включая атопический дерматит, красный плоский лишай, вульгарные угри, себорейный дерматит и очаговую алопецию [22]. А.А. Котов и соавт. (2004) обращают внимание на уровень ОС при ограниченной склеродермии [23]. Нарушения показателей перекисного окисления липидов (ПОЛ), белков и параметров АОС при дерматологических заболеваниях анализировались в исследованиях: при акне [24], псориазе [24, 25], розацеа [26, 27], истинной акантолитической пузырчатке [28], экземе и склеродермии [29], атопическом дерматите [30].
M.G. Davis et al. в 2021 г. установили негативное влияние ОС на кожу волосистой части головы, повреждение волосяных фолликулов, следовательно, на преждевременное выпадение волос [31].
Исследование A. Cwynar et al. (2019) показало изменение уровня малонового диальдегида (МДА), который является продуктом перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот и некоторых сложных эфиров и обычно используется в качестве индикатора ПОЛ. Уровень МДА плазмы в группе пациентов с очаговой алопецией был повышен, что может свидетельствовать об усилении ПОЛ и гиперпродукции СР кислорода при данной патологии [32].
R.M. Trueb et al. (2018) проанализировали влияние перекисей липидов на волосяные фолликулы и обнаружили, что местное применение гидроперекисей линолеина, одного из перекисей липидов, приводит к раннему началу фазы катагена в циклах волос. Кроме того, авторы описали, что перекиси липидов вызывают апоптоз клеток волосяных фолликулов, за которым следует раннее начало фазы катагена. Они также индуцировали апоптоз в эпидермальных кератиноцитах человека путем активации генов, связанных с апоптозом [33].
К настоящему времени имеется ряд описаний поражения кожи при COVID-19 [34–37]. Обсуждается токсическое влияние вируса на волосяной фолликул при развитии постковидной алопеции. На выпадение волос влияют местное и системное воспаление, ОС, состояние тканевой гипоксии, микрососудистая недостаточность, проявляющаяся стойким спазмом капилляров [38].
M. Domínguez-Santás et al. (2020) были первыми авторами, которые сообщили о случае телогеновой алопеции, или telogen effluvium (ТЭ), возникшей через 3 месяца после заражения SARS-CoV-2 [39], затем последовали и другие описания развития ТЭ после COVID-19 [40]. S. Lopez-Leon et al. (2021) зарегистрировали выпадение волос после перенесенного COVID-19 более чем у 25% пациентов [41]. Усиленная потеря волос встречается у пациентов с COVID-19 уже в стадии реконвалесценции. В настоящее время алопеция стала основной жалобой выздоравливающих пациентов после перенесенного COVID-19. Главным образом речь идет о диффузном выпадении волос. Патогенез острой ТЭ, вероятно, связан с повышением уровня провоспалительных цитокинов в плазме, а также с ишемией тканей ввиду цитопатического действия вируса [42].
Влияние продуктов перекисного окисления на микроциркуляторное русло
Важность микроциркуляции (МЦ) как конечного звена всей системы кровообращения обусловлена тем, что именно на этом уровне обеспечивается доставка кислорода к тканям, а значит, расстройства МЦ лежат в основе трофических нарушений, приводят к ухудшению функционального состояния различных органов и систем [43]. Именно система МЦ одной из первых реагирует на любое неблагоприятное изменение условий окружающей среды [44]. Циркулирующие продукты ПОЛ оказывают влияние на клеточные мембраны сосудистого эндотелия, повреждения которых неизбежно ведут к дисфункции сосудов с выраженным нарушением процессов МЦ и развитию гипоксии органов и тканей [45]. Одним из факторов нарушения тока крови в периферических кровеносных сосудах является ПОЛ, продукты которого изменяют эндотелий-зависимую регуляцию сосудистого тонуса [4]. Проведенные исследования COVID-19 выявили, что в основе данного патологического инфекционного процесса находится липопероксидация (ПОЛ) и увеличение прокоагулянтной активности [46].
Цель исследования: комплексная оценка про- и антиоксидантного статусов у пациентов с постковидными алопециями, выявление корреляционных зависимостей про- и антиоксидантного статусов с нарушениями микроциркуляции.
Методы
Состояние системы СРО липидов и белков оценивалось в трех группах пациентов: основная группа включала 26 больных женского пола с постковидной алопецией. Средний возраст пациенток в группе составил 38,4±11,14 года. В основной группе исследования выпадение волос у больных начиналось в среднем через 2,6 месяца после перенесенной инфекции, 42,8% женщин с симптомами алопеции перенесли COVID-19 в тяжелой форме, 57,2% лечились амбулаторно со средней и легкой формами заболевания. Диффузная реактивная алопеция наблюдалась у 47,5% пациенток, у 32,5% – алопеция смешанного генеза, у 17,2% – андрогенетическая алопеция, у 2,8 % – обострение очаговой алопеции.
Группа сравнения включала 13 пациентов женского пола с алопециями другой этиологии, преимущественно андрогенетической, с отсутствием COVID-19 в анамнезе. Средний возраст группы сравнения составил 35,8±11,9 года.
В группу физиологического контроля вошли 10 пациентов женского пола без острых и хронических патологий, без симптомов выпадения волос, средний возраст составлял 26,3±2,08 года.
Определение про- и антиоксидантного балансов осуществляли методом биохемилюминесценции (БХЛ), индуцированной железом и перекисью водорода [47]. Данный метод основан на образовании в биохимических реакциях квантов света. Интенсивность процесса свечения обусловлена наличием в сыворотке крови продуктов с про- и антиоксидантными свойствами. Для регистрации индуцированной БХЛ (ИБХЛ) использовали аппарат биохемилюминометр БХЛ-07 (ООО «Медозонс», Россия), сопряженный с компьютером IBM PC/AT в диалоговом режиме. Результат распечатывался в унифицированной форме в виде хемилюминограммы с оценкой следующих параметров: индекс S, где S (мВ) – светосумма хемилюминесценции за 30 секунд, отражающая содержание радикалов в исследуемом образце, величина обратно пропорциональна антиоксидантной активности пробы крови; tg(-2α) – показатель, характеризующий скорость снижения процессов СРО в плазме; индекс Z – отношение индексов S/Imax, характеризующий уровень антиоксидантной защиты (рис. 1).
Исследование первичных, промежуточных и конечных продуктов липопероксидации (диеновых конъюгатов – ДК, триеновых конъюгатов – ТК, оснований Шиффа – ОШ) является одним из основных направлений в изучении ОС. Анализ данных маркеров липопероксидации позволяет определять не только активность, но и стадийность процессов СРО. Определение уровней продуктов ПОЛ осуществляли в гептан-изопропанольных фракциях [48].
Использовали лабораторную настольную центрифугу СМ-6М (Elmi-Латвия), полипропиленовые центрифужные пробирки объемом 15 мл, стеклянные пробирки объемом 15 мл, спектрофотометр СФ-2000 (ООО «ОКБ Спектр», Россия), оптическую кювету для спектрофотометра толщиной 1 см, дозаторы лабораторные автоматические переменного и постоянного объемов 0,5–1,0 мл. Реактивы: гептан-изопропаноловая смесь в соотношении 1:1 по объему, гептан-изопропанольная смесь в соотношении 3:7 по объему, водный раствор 0,01 Н HCl, хлорид натрия прокаленный. Оценивали каждую фазу против соответствующего контроля при длинах волн: 220 нм (поглощение изолированных двойных связей), 232 нм (поглощение ДК), 278 нм (поглощение ТК), 400 нм (поглощение ОШ). Содержание ДК, ТК и ОШ выражали в относительных единицах.
Определение протеин-ассоциированных карбонильных групп широко используется для оценки выраженности окисления белков. Принцип метода основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона [49]. Методика исследования представлена в работе Т.В. Копытовой и соавт. (2014) [50] и проводится с использованием лабораторного оборудования в виде лабораторной настольной центрифуги СМ-6М (Elmi, Латвия), пропиленовых центрифужных пробирок объемом 10 мл, спектрофотометра СФ-2000 (ООО «ОКБ Спектр, Россия), оптической кюветы для спектрофотометра толщиной 1 см. Использовались следующие реактивы: водный раствор 2,4-динитрофенилгидразина 0,01 М, водный раствор соляной кислоты 2 Н, водный раствор хлорной кислоты 1 н, этанол-этилацетатная смесь в соотношении 1:1 по объему, водный раствор мочевины 8 М. Проводили регистрацию оптической плотности образовавшихся динитрофенилгидразонов: для алифатических альдегид-кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера при длинах волн 356, 363, 370 нм; основного характера – при 430 и 530 нм.
Опытную пробу измеряли против контроля, содержавшего вместо 2,4-динитрофенилгидразина водный раствор соляной кислоты 2 Н (Е.Е. Дубинина и др., 1995). Результаты представляли в единицах оптической плотности (опт. пл.).
Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel 2020 и Statistica 10.
Результаты
Результаты исследования образцов сыворотки крови пациентов методом ИБХЛ продемонстрировали статистически значимое повышение уровня параметра S, характеризующего интенсивность СРО, и параметра Z, характеризующего общую антиоксидантную активность в группе пациентов с постковидным выпадением волос (табл. 1).
Выявленные изменения характеризуют напряженное состояние динамического равновесия между процессами липопероксидации и параметрами общей антиоксидантной активности плазмы в группе пациенток с постковидным выпадением волос.
Результаты определения параметров биохемилюминесценции представлены на рис. 2.
При исследовании продуктов ПОЛ выявлено, что у пациентов с постковидными алопециями уровни ДК и соотношение образования конечных продуктов окисления были статистически значимо выше, чем в контрольных группах: ДК – на 31%, ТК – на 56%, ОШ – на 42% выше по сравнению с группой пациентов с алопециями, не болевших коронавирусной инфекцией. Показатель ТК на 33% был выше в группе постковидных пациентов с алопецией по сравнению с группой здоровых лиц. Показатель отношения ОШ/ТК+ДК был на 45% выше в группе с постковидной алопецией, чем в группе больных без Covid-19, и на 37% выше, чем в группе здоровых лиц (табл. 2). Эти данные подтверждают интенсивность СРО при постковидных алопециях и соотносятся с повышением параметра S при исследовании ИБХЛ.
При определении степени окислительной модификации белков (ОМБ) статистически значимые различия обнаружены при длинах волн 356, 363 и 370 нм. Степень ОМБ (алифатические альдегид-кетон-динитрофенилгидразоны нейтрального характера) в группе постковидных пациентов с алопецией оказалась выше, чем в группах пациентов с алопецией, не перенесших коронавирусную инфекцию, и в группе здоровых людей: при 356 нм – выше на 22 и 7% соответственно, при 363 нм – выше на 25 и 7% соответственно, при 370 нм – выше на 30 и 7% соответственно (табл. 3).
Обобщая результаты данного этапа исследования необходимо отметить, что в группе пациентов с постковидной алопецией при проведении исследования методом ИБХЛ, а также при определении продуктов ПОЛ и степени ОМБ выявлены статистически значимые результаты, свидетельствующие об активации процессов СРО.
Ранее в тех же группах исследования определялось состояние системы гемостаза у пациентов с постковидной алопецией методом тромбодинамики (ТД) [42]. Проводилось определение численных параметров пространственной динамики роста фибринового сгустка и спонтанного тромбообразования: Vst – стационарная скорость роста сгустка вдали от активной поверхности (мкм/мин), оценивающая автоволновую составляющую распространения тромба в пространстве, Tlag – время задержки роста сгустка (мин), Vi – начальная скорость роста сгустка вблизи активаторной области (мкм/мин), CS – размер сгустка на 30-й минуте исследования (мкм). D – относительный показатель плотности образовавшегося фибринового сгустка (усл. ед.), Tsp – время появления спонтанных сгустков (мин).
При оценке показателей теста ТД у больных алопецией, перенесших коронавирусную инфекцию, выявлены нарушения микроциркуляторной функции, активация свертывания, характеризующаяся тромботической микроангиопатией и эндотелиитом, в т.ч. образование фибриновых сгустков. Это подтверждается результатами проведенных исследований, которые выявили у большинства пациентов с постковидными алопециями нарушения системы гемостаза протромботической направленности.
В настоящем исследовании в группе пациентов с постковидной алопецией выявлена статистически значимая положительная корреляция между уровнем триеновых конъюгатов и образованием спонтанных сгустков (Tsp), а также между коэффициентом ОШ/ДК+ТК и параметром задержки роста фибринового сгустка (Tlag), (табл. 4).
При изучении связи окислительной модификации белка (ОМБ) и параметров ТД статически значимая положительная корреляция обнаружена между показателем окисления белков при длине волны 430 нм, отражающим уровень алифатических кетон-динитрофенилгидразонов основного характера и временем задержки роста фибринового сгустка, начальной скоростью роста, размером и плотностью фибринового сгустка. Показатель окисления белков при длине волны 530 нм, регистрирующий уровень алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов основного характера, показал статистически значимую положительную корреляцию со всеми исследуемыми параметрами ТД, кроме образования спонтанных сгустков (табл. 5).
Был проведен корреляционный анализ между параметрами ТД и показателями биохемилюминесцентного анализа (табл. 6).
Обнаружена положительная корреляция между параметром Z ИБХЛ, стационарной и начальной скоростями роста фибринового сгустка и размером фибринового сгустка. Также найдена отрицательная корреляция между показателем ИБХЛ tg(-2а), показателями начальной скорости роста сгустка и плотностью образовавшегося фибринового сгустка.
Таким образом, у пациентов с постковидными алопециями выявлена четкая взаимосвязь активации процессов СРО с нарушениями системы гемостаза.
Выводы
На основании результатов проведенного исследования можно сделать вывод об участии ОС в патогенезе постковидной алопеции. Об активации свободнорадикальных процессов у пациентов с постковидной алопецией свидетельствует повышение первичных и конечных продуктов ПОЛ, увеличение уровня окисленных белков и параметра S при проведении исследования методом ИБХЛ, отражающего содержание СР в сыворотке крови, что свидетельствует о дисбалансе окислительно-восстановительной системы. Как правило, причиной активации процессов ПОЛ является напряжение и истощение АОС защиты.
Обширный воспалительный процесс, происходящий в организме во время новой коронавирусной инфекции, вызывает ОС и апоптоз, провоцирует переход волосяного фолликула в ранний катаген и телоген, что и лежит в основе изучаемой патологии – постковидной алопеции.
Выявленные корреляционные зависимости позволяют сделать вывод о значимой связи между процессами СРО и функционированием системы гемостаза. На основании результатов проведенного исследования и данных литературы можно сделать следующее заключение: в патогенезе постковидной алопеции значимое место занимают ОС и нарушения гемостаза.
С учетом выявленных изменений показателей перекисного окисления и состояния АОС у пациентов с постковидным выпадением волос следует рекомендовать включение в обследование больных с жалобами на выпадение волос после перенесенной коронавирусной инфекции описанные в данной статье методы исследования. Данный диагностический спектр позволит более подробно оценить состояние пациента и сформировать комплексный протокол лечения.
В клинической практике описан опыт применения лекарственных препаратов с сосудоукрепляющим, капилляропротективным действиями для больных дерматозами с диагностированными сосудистыми нарушениями [51]. С учетом патогенетических механизмов, участвующих в развитии постковидной алопеции, для нормализации микроциркуляторных расстройств кожи волосистой части головы, укрепления сосудистой стенки, нормализации уровней свободнорадикальных реакций целесообразно рекомендовать включение в комплексное лечение постковидного выпадения волос витаминов, обладающих антиоксидантной активностью и препаратов, укрепляющих сосудистую стенку и улучшающих микроциркуляцию.
Вклад авторов. А.Ю. Николаева, О.А. Биткина, И.В. Кошелева, К.Н. Конторщикова, М.В. Преснякова, А.А. Дмитриева, М.Г. Бельчева, Е.В. Биткина – концепция и дизайн статьи. А.Ю. Николаева, О.А. Битки-на – написание текста. И.В. Кошелева, К.Н. Конторщикова, М.В. Преснякова, А.А. Дмитриева, М.Г. Бельчева, Е.В. Биткина – редактирование.
Дополнительная информация
Публикация статьи осуществляется в рамках диссертационного исследования Николаевой А.Ю.: «Разработка алгоритма обследования и лечения постковидных алопеций на основании изучения состояния микроциркуляции, особенностей метаболизма».
